层析相位显微术(TPM)是一种光学显微技术，可以在不使用外源性标记的情况下重建单个细胞折射率(RI)的三维空间分布。它提供了细胞生物物理特性的定量表征(机械、电气和光学)，从TPM提供的3D数据中可以检索或推断细胞的各种信息，例如：从健康组织中区分出癌细胞，或判断药物对细胞疾病是否具有预期的效果；通过获得细胞表型、形态发生的信息来可视化和测量亚细胞结构，通过评估亚细胞的数量和大小来推断某些功能。TPM在生物医学领域具有巨大潜力，并推动了个性化医疗的临床应用。

TPM最重要的特点是其获得的单细胞3D信息是定量的，并且是在没有化学标记的情况下实现的。这意味着TPM是一种无损的显微技术，细胞可以在其自然状态下进行观察和分析，而不受可改变其形态或功能的外源性试剂的毒性作用的影响。这避免了与细胞染色相关的常见问题，如费用昂贵、改变整体成像(光漂白)或改变细胞生理(光损伤)等。传统的TPM系统在静态条件下工作，限制了进行高通量实验的可能性，而低通量的分析可能会丢弃细胞内的变异性，这对于分析细胞多样性或寻找具有特定特征的稀有细胞(如肿瘤细胞、干细胞等)是必不可少的。在这种背景下，成像流式细胞术(FC)代表了高标准技术，因为它结合了显微镜的单细胞成像能力和FC的高通量能力。在传统的成像FC中，每秒采集数以千计的二维图像，但其信息量往往局限于细胞形态和基于荧光的特征。因此，将TPM的3D无标记定量单细胞分析与成像FC的高通量单细胞记录相结合，有望在生物医学中开辟新的强大应用或加强现有的应用。

另一方面，脂滴(Lipid Droplets, LDs)的分析是一个不断发展的领域。脂滴最初被描述为脂肪储存细胞器，现在被认为是动态的实体，在细胞内发挥某些关键的作用。事实上，LDs已被发现在多种疾病中发挥作用，包括糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪性肝病、病原体感染、神经退行性疾病和癌症。此外，它们被认为是炎症的结构标记物，因为在炎症刺激下，免疫细胞中LDs的数量和大小迅速增加。最近的证据表明，与健康献血者相比，来自COVID-19患者的单核细胞显示出更高的LDs积累，这表明LDs可能参与了SARS-COVID-2的发病机制。尽管特定LD结构特征与特定功能之间的联系机制尚不明确，但大量证据表明LDs数量、大小、超微结构、运动性、脂质/蛋白质含量以及与其他细胞器相互作用的变化显著影响许多细胞过程。此外，LDs与细胞内大多数细胞器具有动态相互作用，包括线粒体、过氧化物酶体、溶酶体、高尔基体和细胞核等。因此，它们在细胞体积内的三维空间组织可能是潜在的疾病生物标志物。

迄今为止，以无损、高通量的方式解析LDs的数量、大小以及与其他细胞器的相互作用等参数一直是难以实现的，特别是在评估LDs三维空间组织方面。用于LDs分析的标准技术，即透射电子显微镜(TEM)和荧光显微镜(FM)，虽然具有高度的特异性和灵敏度，但其主要缺点是只能在细胞的小部分体积上提供二维图像。此外，这两种方法都是破坏性的和低通量的。

意大利国家研究委员会应用科学与智能系统研究所(CNR-ISASI)的Pietro Ferraro研究小组和博洛尼亚大学的研究小组合作，基于最近开发的一种工具，即流式细胞术中的层析相位显微镜(TPM-FC)，提出了一种新的生物医学应用。该工作探讨了TPM-FC对脂滴(LDs)的三维识别和定量表征，首次在活悬浮细胞中可视化和定量地测量了沿着微流体通道流动的LDs。该方法基于TPM-FC，允许同时检索LD的3D形态学和基于RI的特征及其3D位置。数值图像处理用于检索每个检测到的LD的表型及其空间相关性并定位到3D细胞体积中。为了测试该策略的鲁棒性和可靠性，研究人员对人卵巢癌细胞和单核细胞进行了研究，并与TEM和FM成像技术进行了比较。在获得结果的基础上，将有可能对大量细胞进行研究，从而在无标记和无损的模式下完成显著的统计分析。

图1 TPM-FC对活悬浮细胞中LDs的断层重建

得益于该项研究，TPM-FC在实验记录和数值处理方面都取得了进展，成功地解决了实际生物医学问题，同时推动了无标记细胞成像的研究方向。所提出的无损成像方法能够分析大量细胞，并提供与LDs内部分布相关的可量化信息，有望对LDs生物学领域做出巨大贡献，从而更详细地剖析其作用，充分发挥其临床潜力。研究结果表明，该方法是检测高通量流动样品中细胞内LDs的存在和分布的新途径，使得在生物医学中开发新型诊断或治疗工具成为可能。

该工作以“3D imaging lipidometry in single cell by in-flow holographic tomography”为题作为封底文章发表在我所主办期刊Opto-Electronic Advances （光电进展）2023年第1期。

研究团队简介

意大利国家研究委员会应用科学与智能系统研究所(CNR-ISASI)的费拉罗小组和博洛尼亚大学(医学与外科学系、药学与生物技术系和实验、诊断与专科医学系)的三个研究部门之间的跨学科合作取得了丰硕的研究成果。ISASI-CNR的研究小组是全球数字全息领域的领军团队之一，其提出了流式细胞层析相位显微术(TPM-FC)的概念。博洛尼亚大学的研究团队包括肿瘤生物学家和一位医学博士，研究涵盖了分子遗传学、生物化学、细胞生物学和病理学等领域。特别是，博洛尼亚大学的研究团队还在积极研究代谢重编程如何促进癌症发展。这项合作研究已经达到了显著的结果。

相关论文

Pirone D, Sirico D, Miccio L, Bianco V, Mugnano M et al. 3D imaging lipidometry in single cell by in-flow holographic tomography. Opto-Electron Adv 6, 220048 (2023).

DOI: 10.29026/oea.2023.220048

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